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    氨基酸衍生化及气相色谱-质谱分析

    发布时间:2021-12-31

      氨基酸通常用高效液相色谱法分析。然而,也可以使用液相色谱,在某些情况下,出于仪器可用性或运行成本的考虑,这种方法将是更好的选择。在进行液相色谱分析之前,有必要对氨基酸的极性进行衍生。衍生化旨在使分析物更易挥发,反应性更低,从而改善其色谱行为。对于氨基酸,衍生化用非极性基团取代了OH、NH2和SH极性官能团上的活性氢。

      甲硅烷基化是一种非常常见的衍生技术,可用于多种化合物。这种方法的主要缺点是对水分敏感。如果有水,可能会导致反应产率低和衍生分析物不稳定。本研究对甲硅烷化试剂N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺在氨基酸衍生化中的应用进行了评价。当与含有活性氢的极性官能团反应时,MTBSTFA形成叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)衍生物:

          

      MTBFA衍生物比使用较低分子量试剂形成的衍生物更稳定,对水更不敏感,如N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA) 。


      实验

      将含有91g/mL  L-氨基酸和0.1 N  HCl混合溶液的50 L等分试样,加入100 L纯MTBSTFA,然后加入100L乙腈?;旌衔镌?00加热。持续4小时。然后,样品用碳酸氢钠中和,在20米 0.18毫米内径0.18微米SLB-5质谱毛细管柱上进行气相色谱-质谱分析。


      结果

      氨基酸的三丁基锡化合物衍生物的色谱图如图2所示。从该峰获得的光谱数据有助于识别氨基酸衍生物。用三丁基锡化合物取代活性氢,分子量增加了114。这些衍生物的电子碰撞光谱2包含对应于衍生物分子量降低的典型片段CH3(M-15)、C4H9(M-57)、C4H9 CO  (M-85)和CO-O-TBDMS  (M-159)。图3显示了TBDMS-缬氨酸光谱中这种片段模式的例子。
                

      在所用的反应条件下,大多数氨基酸产生一种衍生物,羟基、胺基和巯基(在半胱氨酸的情况下)中的活性氢被三丁基锡化合物取代。一些氨基酸产生各种衍生物,尤其是天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸。对于上述氨基酸,反应条件的改变,如降低温度或改变反应时间,可以防止这种情况的发生。例如,将反应时间从2小时增加到4小时会导致完全衍生的色氨酸的反应增加。尽管三丁基锡化合物衍生物比传统的三丁基锡化合物衍生物更稳定,但其较高的分子量导致气相色谱分析中的洗脱时间更长。为了平衡这一点,使用更短更细的毛细管柱进行分离。为了保持甘氨酸衍生物峰在溶剂中的分辨率,起始温度不高于100。胱氨酸衍生物洗脱后,迅速升温至360,保证色谱柱清洁,便于后续分析。


      结论

      研究表明,适当使用衍生化试剂,如甲基叔丁基醚,可以用气相色谱-质谱联用技术分析氨基酸。为了实现目标衍生物的最大响应,可能需要“调整”反应条件。衍生物可以形成用于质谱鉴定的特征片段。为了减少这些衍生物的总气相色谱分析时间,建议使用更短和更薄的色谱柱,如20 m  x  0.18 mm内径x  0.18微米SLB-5 ms

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